荐读 | 纳米微球负载抗生素/羟基磷灰石复合支架的缓释性能及治疗感染性骨缺损的研究

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荐读 | 纳米微球负载抗生素/羟基磷灰石复合支架的缓释性能及治疗感染性骨缺损的研究 2023年05月15日

感染性骨缺损在临床上非常常见，其致病菌主要为金黄色葡萄球菌^[1]。交通事故和爆炸伤的增多使其发病率逐渐上升^[2]。长期静脉应用抗生素治疗感染性骨缺损可导致身体毒性。载抗生素的聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）已被广泛用于治疗骨感染性疾病^[3]。PMMA的优点是可在局部获得较高的药物浓度，避免了静脉用药的副作用；其主要缺点是不可降解、不能释放全部药物^[4]。基于目前研究现状，研发一种具有良好生物相容性、药物缓释性能、可控吸收、良好生物力学性能的骨修复材料对治疗感染性骨缺损具有重要意义。

纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite，n-HA）的结构与人体骨组织相似^[5]，其具有良好的生物活性和相容性，n-HA被认为是最有前途的骨修复材料之一^[6]。n-HA负载万古霉素复合材料已成功用于治疗感染性骨缺损^[7]。聚氨酯（polyurethane，PU）是一种可生物降解的材料，已被广泛用于骨组织工程^[8]。纳米羟基磷灰石/聚氨酯（n-HA/PU）多孔骨修复支架材料具有优良的生物相容性和成骨作用。介孔二氧化硅纳米粒子（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）由Kresge等^[9]首次发现，具有大孔体积、可控孔径、高比表面积等特点，已被广泛应用于生物纳米技术和纳米医学领域^[10]。许多药物和生物分子，如DNA或siRNA封装在MSNs中用于治疗癌症^[11]。左氧氟沙星是一种从氧氟沙星中分离出来的Ⅲ类氟喹诺酮类抗生素。其抗菌性能是氧氟沙星的2倍，具有低分子量，通过静电吸引易于与MSNs结合。本研究以多孔n-HA/PU复合支架作为载体，将含有抗生素的MSNs分布于其多孔表面，合成了一种新型介孔硅纳米微球载药控释抗菌骨修复材料，并评价该新型复合支架材料的体外缓释性能及其治疗感染性骨缺损的疗效。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

24只新西兰兔由菏泽医学专科学校动物实验中心提供，其中雌性12只，雄性12只，体重在2 ～ 4 kg之间，单笼饲养。动物生产许可证号：[SCXK（鲁）-2018-0006]，动物使用许可证号：[SYXK（鲁）-2019-0019]。本实验研究经菏泽医学专科学校附属医院伦理委员会审核并通过（2021-016），并严格遵守“3R”原则。

1.1.2 主要药物、试剂与仪器

蓖麻油、甘油、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、原硅酸四乙酯（TEOS）（中国阿拉丁有限公司）；1,4-丁二醇（BDO）和辛酸亚锡（中国成都科龙有限公司）；左氧氟沙星、甲醛溶液、乙酸乙酯（中国国药集团化学试剂有限公司）；聚甲基丙烯酸甲酯粉末（Palacos R+G，德国Heraeus Medical GmbH公司）。高效液相色谱仪（LC-2010AHT，日本岛津公司）；超声波清洗器（KQ2200B，昆山市超声仪器有限公司）；高速离心机（D-37520，美国Sigma公司）；循环恒温水浴锅（TB-85，日本岛津公司）；组织匀浆机（T10 basic S25，德国IKA公司）；Micro CT扫描仪（μCT40，瑞士Scanco医疗）；Scanco医疗系统（SC5073，μCTv6.1版，瑞士Scanco医疗）；硬组织切磨系统（E300CP，德国EXAKT公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 介孔硅微球/羟基磷灰石复合支架材料的合成

介孔二氧化硅纳米粒子的合成是采用Kim等^[12]报道的方法。将含有Fe₃O₄的油酸悬浮液放入含有十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的水溶液（10 mL）中，转移到水相中形成透明分散体。将分散体和NaOH（2 mL）加入水中，然后在70℃下加热10 min。乙酸乙酯（2 mL）和硅酸四乙酯（TEOS）（0.5 mL）在70℃下缓慢加入溶液。当溶液的pH降低CTAB和Fe₃O₄均分离为纳米晶体。精确称量5 mg左氧氟沙星粉末，将其加入5 mL的水溶液中，超声处理2 min。将其分成5份含有左氧氟沙星的1 mL水溶液，将二氧化硅纳米颗粒加入其中，将混合物在25℃下振摇2 h。根据笔者的前期研究方法合成纳米羟基磷灰石^[13]，将尺寸为10 mm×6 mm×6 mm的n-HA/PU浸泡到Lev@MSNs悬液30 min，在40℃真空干燥器中干燥。Lev/MSNs固化在n-HA/PU多孔支架材料表面。使用扫描电子显微镜观察复合支架的表面和纳米微球的形态。

1.2.2 载抗生素骨水泥的制备

称量5 mg左氧氟沙星粉末，称量0.38 g PMMA粉末。左氧氟沙星粉末均匀地与PMMA粉末充分搅拌混合。将该混合粉末与含有甲基丙烯酸甲酯的0.19 mL液体混合。然后混合小心搅拌30 s。随后将混合物分装放入5个模具材料（10 mm×6 mm×6 mm）中。10 min后去除模具可得载有1 mg左氧氟沙星的聚甲基丙烯酸甲酯材料（1 mg Lev/PMMA）。所有材料均使用γ-60（15 KJY）辐照灭菌。

1.2.3 体外缓释性能

分别将1 mg Lev/n-HA/PU组和1 mg Lev/PMMA组各3个样品浸入含有1 mL无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）的试管中，并在37℃下持续摇动。在1、2、3、4、5、6 d，1、2、3周的不同时间点。取出样品，浸入装有1 mL新PBS的试管中。使用高效液相色谱（HPLC）方法检查每个PBS溶液中的抗生素浓度。

1.2.4 兔胫骨感染性骨缺损模型的建立

使用Norden法^[14]制造兔胫骨感染性骨缺损模型。麻醉后将兔子固定在支架上。使用碘伏溶液消毒右侧胫骨的手术部位。做一个与胫骨平行长2 cm的纵向切口。在髓腔中钻了1个直径为3 mm的孔。0.1 mL鱼肝油酸钠注入髓腔。5 min后将0.1 mL含有3×107 CFU/mL浓度的金黄色葡萄球菌液体注入胫骨髓腔。骨蜡封孔，防止细菌泄漏。

1.2.5 植入材料

采用Rissing法^[15]进行大体病理学评估，包括局部皮肤有无红肿、流脓、窦道形成等指标。采用Smeltzer法^[16]进行病理学评估，包括炎症反应、死骨形成等指标。采用Norden法^[17]进行放射学评估。注入细菌4周后，所有兔均成功建立感染性骨缺损模型。所有动物均进行清创（10 mm×6 mm）并随机分为4组。a组（n=6）中的动物仅接受单纯清创作为空白对照，为单纯清创组；b组（n=6）中的动物植入1 mg Lev/PMMA，为1 mg Lev/PMMA组；c组（n=6）中的动物植入n-HA/PU作为阴性对照，为n-HA/PU组；d组（n=6）中的动物植入1 mg Lev/n-HA/PU，为1 mg Lev/n-HA/PU组。在植入材料后6周和12周，进行了一般情况观察、X射线成像、Micro-CT评估和组织病理学评估。手术操作过程如图1所示。

图1 植入材料的过程：A. 暴露胫骨，选定清创区域与大小（10 mm×6 mm）；B. 彻底清创并开窗；C. 植入复合支架材料；D. 逐层缝合

1.2.6 Micro-CT扫描

将每组的3只兔子安乐死后，取出胫骨，将胫骨切成小块并去除周围的软组织。使用Micro CT扫描仪扫描样本。Scanco成像系统用于重建材料的3D图像。最接近材料的区域（尺寸：200×80）被选为感兴趣区域，以检测新骨形成，选定区域不包含皮质骨。选取每个样本的100张CT图像用于分析，每个样品使用相同大小的区域。评估指标：骨体积与总体积比（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb. Th）和新生骨小梁数量（Tb. N）。

1.2.7 放射学和大体病理学观察

观察兔胫骨大体病理学，皮肤有无破损，有无窦道形成、脓液流出。使用3%戊巴比妥（1.0 mL/kg）静脉注射麻醉兔子，然后将兔子固定在支架上。分别在植入材料后6周、12周两个时间点进行X射线成像。仪器参数为250 mA、44 kVp，曝光时间为2.8 mAs。

1.2.8 组织学评价

用Micro CT扫描胫骨后，将胫骨浸泡在4%多聚甲醛中用于组织学检查。用流水冲洗胫骨1 h。每个胫骨分别用60%、70%、80%、90%、100%乙醇脱水2 d。将未脱钙的胫骨嵌入甲基丙烯酸甲酯中7 d。每个样品使用硬组织切磨系统在200 μm处的纵轴切割。将硬组织切片抛光至30 μm用于Van Gieson染色（VG），观察新骨形成。

1.3 统计学方法

运用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，各组间差异使用最小显著差异法（least significant difference，LSD法）进行分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 合成的材料

新合成的空白n-HA/PU多孔支架材料具有大量孔隙，孔隙大小均匀（见图2A），材料尺寸为10 mm×6 mm×6 mm。载抗生素后的复合支架材料如图2B所示，载抗生素的PMMA作为对照（见图2C）。分别经SEM扫描可见n-HA/PU具有多孔结构（见图2D），1 mg Lev/n-HA/PU材料的孔隙表面有大量的介孔氧化硅颗粒（见图2E），复合支架的平均孔隙率为（54.46±5.68）%。左氧氟沙星通过静电作用吸附于MSNs（见图2F）。

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图2 新合成的多孔复合支架材料：A. 空白n-HA/PU支架材料；B. 载抗生素后的n-HA/PU材料；C. 载抗生素的PMMA；D. 空白n-HA/PU的扫描电镜图；E. 1 mg Lev/n-HA/PU材料的扫描电镜图；F. 左氧氟沙星与MSNs结合的模式图；G. 左氧氟沙星的分子结构

2.2 支架材料的体外缓释试验

两组材料的累积抗生素释放曲线如图3所示。第1 d，1 mg Lev/n-HA/PU组和1 mg Lev/PMMA组均表现为爆发性抗生素释放，1 mg Lev/PMMA组的抗生素释放量（58.23 μg/mL）高于对照组1 mg Lev/n-HA/PU组（47.14 μg/mL）。第2 d，1 mg Lev/PMMA组（7.366 μg/mL）的抗生素释放量与1 mg Lev/n-HA/PU组（7.31 μg/mL）相似。在第3 ～ 7 d，1 mg Lev/n-HA/PU组的抗生素释放量均高于1 mg Lev/PMMA组。1 mg Lev/n-HA/PU组比1 mg Lev/PMMA组释放的抗生素更多，缓释性能表现更好。

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图3 支架材料的体外缓释试验：A. 1 mg Lev/n-HA/PU组的体外缓释；B. 1 mg Lev/PMMA组的体外缓释

2.3 放射学评价

在植入后6、12周时，单纯清创组可见感染引起的明显骨质破坏和死骨形成（见图4）。单纯清创组在植入后12周时的骨缺损面积较植入后6周时变大。植入后12周时1 mg Lev/n-HA/PU组未见炎症反应，无骨破坏和明显骨缺损。在1 mg Lev/PMMA组中观察到不降解的骨水泥材料。

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图4 植入后的放射学评价：A. 单纯清创组；B. 1 mg Lev/PMMA组；C. n-HA/PU组；D. 1 mg Lev/n-HA/PU组

2.4 胫骨的3D重建图

在植入后6周时，单纯清创组可见骨破坏和骨缺损。n-HA/PU组和1 mg Lev/n-HA/PU组的复合支架保持完整没有降解。在n-HA/PU组和1 mg Lev/PMMA组中，可见支架材料周围少量的新骨形成。在1 mg Lev/n-HA/PU组的支架周围观察到新的骨小梁形成。在植入后12周的时间点，单纯清创组表现为胫骨局部骨缺损，无明显新生骨。在1 mg Lev/n-HA/PU组中，新生的骨小梁紧密地附着在复合支架上，几乎填满了整个骨髓腔。然而在n-HA/PU组和1 mg Lev/PMMA组中只能观察到很少的新生骨小梁。各组植入后的3D重建如图5所示。

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图5 胫骨及复合支架材料的3D重建：A. 单纯清创组；B. 1 mg Lev/PMMA组；C. n-HA/PU组；D. 1 mg Lev/n-HA/PU组

2.5 新生骨小梁

在植入后6周时，1 mg Lev/n-HA/PU组的新骨生成量（BV/TV）均与其余三组有统计学差异（P＜0.05）。在植入后12周时，1 mg Lev/n-HA/PU组的新骨生成量（BV/TV）均高于其余三组（P＜0.05，见图6）。同时，n-HA/PU组与1 mg Lev/PMMA组的新骨生成均高于单纯清创组（P＜0.05）。在植入后6周时，各组之间新生骨小梁的数量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在植入后12周时，n-HA/PU组与1 mg Lev/PMMA组的新生骨小梁的数量均高于单纯清创组（P＜0.05）。在植入后12周时，1 mg Lev/n-HA/PU组的新生骨小梁的厚度均与其余三组差异有统计学意义（P＜0.05）。

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图6 Micro CT评估新骨生成量：A. 各组新骨生成量（BV/TV）；B. 各组新生骨小梁数量（Tb. Th）；C. 各组新生骨小梁厚度（Tb. N）

注：a组为单纯清创组；b组为1 mg Lev/PMMA组；c组为n-HA/PU组；d组为1 mg Lev/n-HA/PU组。

2.6 VG染色

在植入后12周时由于炎症反应导致骨破坏，单纯清创组骨质较稀疏（见图7A）。在1 mg Lev/PMMA组材料表面，可见明显界限，有新生骨小梁迁延生长（见图7B）。在n-HA/PU组、1 mg Lev/n-HA/PU组材料的内部，新生骨小梁沿孔隙生长。其中1 mg Lev/n-HA/PU组材料与骨小梁相互缠绕，结合紧密（见图7）。

图7 VG染色：A. 单纯清创组骨质较稀疏；B. 1 mg Lev/PMMA组可见明显的材料与骨界线：C. n-HA/PU组表面可见新生骨小梁沿孔隙生长；D. 1 mg Lev/n-HA/PU组支架表面与骨小梁相互缠绕、结合紧密

3 讨论

感染性骨缺损的治疗需彻底清除死骨和感染的软组织，同时静脉应用抗生素4 ～ 6周^[18]。其主要缺陷是局部的抗生素浓度达不到最小抗菌浓度，同时长期静脉应用抗生素会对身体产生毒性，给患者带来巨大的经济负担，对外科医生来讲是一个巨大的挑战。因此，局部应用抗生素治疗感染性骨缺损成为了骨科学者研究的热点。

骨修复材料负载抗生素作为药物缓释系统可以维持抗菌剂的局部浓度。Charnley等^[19]最早将PMMA骨水泥应用于骨科手术。负载抗生素的PMMA骨水泥材料被广泛用于治疗骨感染性疾病^[20]。然而PMMA链珠的缺点是不能持续释放抗生素，且只能释放小部分抗生素，其不可降解，需二次手术取出^[21]。骨水泥凝固产生的热量影响抗生素的抗菌活性。因此，临床上需要一种具有可降解、生物相容性好、良好的骨传导性、具有药物缓释性能的新型骨修复材料。

纳米羟基磷灰石（n-HA）是人体骨骼的主要无机成分^[22]。由于其具有生物相容性好、无毒、良好骨传导性的特点，可以作为抗生素、金属离子、生物活性因子的载体用于治疗骨科疾病^[23]，它在骨组织工程领域被广泛用于骨替代材料^[24]。PU是由异氰酸酯形成的硬链段和聚醚形成的软链段组成的嵌段共聚物。因其良好的柔韧性、生物降解性和细胞相容性而引起广泛关注^[24]。由于PU在共聚过程中具有自发泡的特点，有助于制作多孔支架复合生物材料。n-HA与PU的组合弥补了PU生物强度差的缺点^[25]。Jackson等^[26]设计了几种比例的PU和n-HA复合材料，其发现80/20比例的PU/n-HA复合物可为细胞黏附、增殖和体外成骨分化提供最佳环境。本研究中将PU与n-HA采用发泡法合成复合支架材料，通过SEM扫描可见支架材料具有多孔结构，均匀分布的多孔增加了复合材料的体表面积，有助于MSNs在其表面的均匀分布。

Zhang等^[27]报道了一种具有体积大、孔径可控、结构可调等特点的MSNs。MSNs在纳米医学和生物纳米技术中作为药物缓释系统得到了广泛的研究。Poostforooshan等^[28]将阿莫西林成功负载于MSNs，并表现出了良好的生物相容性及体外抗菌性能，同时也评价了以MSNs作为载体治疗胰腺癌的疗效。Zhou等^[29]将万古霉素负载于MSNs用于治疗感染性骨缺损，负载万古霉素的MSNs表现出良好的缓释性能、生物相容性，促进了骨缺损的修复。

金黄色葡萄球菌是导致感染性骨缺损的常见致病菌，本实验选择左氧氟沙星的依据是其为第三代喹诺酮类药物，其抗菌性能是氧氟沙星的2倍，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出良好的抗菌能力^[30]，且其分子量小，易与纳米微球结合。本研究将左氧氟沙星吸附于MSNs后，将其与n-HA/PU复合。首先评价了新型复合支架材料的体外缓释性能，体外缓释试验表明，1 mg Lev/n-HA/PU组与1 mg Lev/PMMA组分别在第一天释放量最多，在之后的时间点1 mg Lev/n-HA/PU组较对照组表现出来更好的药物缓释曲线，证实了MSNs负载抗生素后具有良好的缓释性能。笔者通过建立动物模型评价复合支架材料的疗效。在建立兔胫骨感染性骨缺损动物模型之前，笔者首先开展了预实验，选用了最常见的致病菌——金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。将菌液分成3×10⁶、3×10⁷、3×10⁸、3×10⁹ CFU/mL 4个浓度梯度，在胫骨局部注入菌液后，评价皮肤有无红肿、窦道形成、脓液流出、放射学炎症性骨破坏等多个指标，选择3×10⁷CFU/mL作为最佳建模浓度。选择适宜浓度的菌液和运用经典的Norden建模方法是建模成功率高的原因。

Padrão等^[31]将万古霉素负载于n-HA/胶原蛋白生物复合材料，其药物缓释可持续19 d，可有效治疗感染性骨缺损。本研究合成的新型复合支架材料可在体外缓慢释放3周。其在植入体内后局部持续缓慢释放左氧氟沙星控制了炎症反应。大体病理学结果显示空白清创组炎症反应明显、窦道形成。而1 mg Lev/n-HA/PU组局部无明显炎症反应。1 mg Lev/n-HA/PU组的新生骨小梁量均与其余3组比较，差异有统计学意义。3D图显示新型复合支架材料周围有大量新生骨小梁生成。这些结果表明，炎症反应的消除和复合材料的骨诱导可以为新骨的生长提供合适的环境。由于此研究动物模型数量有限，仅选取了植入后6周和12周的两个时间点，未评价材料植入后抗生素在局部组织中的缓释性能，新型复合支架材料在体内的局部缓释性能需要进一步评价。

本研究中，笔者将负载左氧氟沙星的MSNs与n-HA/PU相结合，合成了一种新型复合支架材料，用于治疗感染性骨缺损。体外实验证实了其具有良好的药物缓释性能。将其植入动物体内12周后，新型复合支架材料具有良好生物相容性、抗感染能力、骨诱导能力，以期为感染性骨缺损的治疗提供新的解决方案。

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