目的：探讨3D打印工艺制造的多孔WE43镁合金支架的生物相容性，并观察其治疗新西兰大白兔股骨缺损的效果。方法：利用Sprague Dawley（S-D）大鼠骨髓间充质干细胞进行体外细胞毒性试验。根据培养液不同， 将细胞分为 100%浸提液组、50%浸提液组、10%浸提液组及对照组，将各组细胞分别培养1、3及7d 后，采用细胞计数试剂盒8（cellcountingkit-8，CCK-8）法测定各组细胞活性。体内实验中，随机将3.0~3.5kg新西兰大白兔分成实验组、骨水泥组与空白组3组，每组9只。每只均对左侧股骨外侧髁进行手术，利用骨钻制造直径5mm、深6mm的骨缺损，其中实验组植入WE43镁合金支架，骨水泥组植入硫酸钙骨水泥，空白组不做植入。在术后4、8与12周分别对每组3只进行二氧化碳麻醉法安乐死，对股骨及重要内脏器官进行取材。对左股骨外侧髁进行微计算机断层扫描（micro-computed tomography，Micro-CT）。对重要内脏器官制备切片，并使用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，对股骨外侧髁制作硬组织切磨片，使用亚甲基蓝酸性品红染色，在显微镜下观察。结果：细胞毒性试验中，培养1d时，100%浸提液组细胞存活率高于对照组（140.56% vs. 100.00%，P<0.05）；培养3d时，各组细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05）；培养7d时，100%浸提液组细胞存活率低于对照组（68.64%vs.100.00%，P<0.05）。体内实验中Micro-CT扫描发现实验组在4周时大部分支架均已降解，高密度的支架所剩很少，12周时已无明显支架轮廓。在4周时，WE43镁合金支架周围有一定量气体生成，在8~12周时，气体明显减少。硬组织切磨片显示，实验组4周时支架周围有一定量 细胞外基质和类骨质生成，骨水泥组中硫酸钙骨水泥已大部分降解。8 周时实验组支架及其降解产物周围的类骨质明显增多，12周时实验组支架周围有新生骨与支架接触，骨水泥组与空白组新生骨较少。结论：3D打印工艺制造的多孔WE43镁合金支架生物相容性良好，具有良好的成骨性能，有潜力成为修补骨缺损的新型材料。

[关键词] 生物可降解植入物；骨移植物；镁合金；3D 打印；骨缺损

骨缺损是非常严重的骨骼疾患 ，常由创伤、骨髓炎、骨肿瘤等原因引起 ，骨移植是治疗骨缺损的重要手段 ，每年全球有超过200万例骨移植[1]。对于骨缺损的治疗 ，自体骨移植是金标准，能获得较好的疗效，但也受制于数量有限，以及会对供体部位造成损伤。同种异体骨有着相对丰富的来源，但其只能作为骨填充，缺乏骨诱导能力 ，且可能会引起免疫排斥反应和增加感染传染病的风险[2]。人工骨如磷酸钙及硫酸钙，拥有与人体骨结构无机盐的成分，可以填充骨缺损，但缺乏骨诱导及较为持久的骨支撑[3] 。利用外固定架牵张成骨技术可以修复四肢长骨干的缺损，但需要较长时间，且对干骺端的修复因解剖形态的不匹配而产生困难  [4] 。在整体填充大段骨缺损并可以获得良好力学支撑方面，钛合金（Ti6Al4V）的3D打印产品可以拥有良好的解剖形态匹配，以及利用微孔结构调控其弹性模量，可以较好的修复大段的及解剖形态各异的骨缺损，获得一定的临床疗效，但是因为其不可吸收，随时间的推移，骨结构与假体之间的相对稳定及应力的传导等长期疗效还有待观察[5-6] 。在寻找骨缺损的填充材料方面 ，还需要整体支撑力较强、 有骨诱导能力 、可随着时间推移降解的新型材料作为骨填充的优秀产品。

可降解金属作为骨填充材料具有一定的优势，许多可降解金属合金与骨的力学性能相对一致，弹性模量与皮质骨相近，可有效减弱了应力遮挡效应[7]。可降解金属在降解后可有效减少二次手术取出的情况，并为新生骨的生长保留更多的空间。有研究显示，可降解金属的降解产物具有一定的生物活性，如促进体内细胞增殖及促成骨等[8]。在可降解生物活性金属中，镁及镁合金正在被广泛研究。镁在生理环境中降解生成的可溶性产物是无毒的，并会随尿液和粪便排出体外，这奠定了镁合金更好的安全性[9-10]。镁离子是人体必需的元素，具有广泛的生物学活性。镁合金在体液环境下缓慢被腐蚀，产物有很多种，如镁离子、氢氧化镁、碳酸镁等。许多体内和体外的实验均表明，镁离子及氢氧化镁等具有促进骨形成的作用[11-12]。许多研究表明，镁合金可以增加成骨细胞碱性磷酸酶的表达[13-15] 。Li 等[16]在一篇研究中表示和钛植入物相比，镁合金可显著增加植入物周围的成骨细胞。He等[17]在体外使用不同浓度梯度（0 ~3 mmol/L）的镁离子培养人成骨细胞，发现在上述浓度梯度之间，镁离子对成骨细胞的增殖及成骨效应随浓度的增加而增加。

3D打印技术使镁合金的个性化打印成为可能 ，可以制造解剖形态匹配的多孔结构支架 。本研究采用了3D打印WE43镁合金支架作为研究目标，探讨 3D打印的镁合金支架的降解特性 、生物相容性及成骨性能。

1.1 材料

3D打印WE43镁合金支架其主要成分为镁、钇、钕、钆和锆元素，由清华大学机械工程系提供，如图1所示，直径5mm，高6mm，孔隙率 60%，杨氏弹性模量(2040.67±100.00) MPa，屈服强度(31.52±1.36) MPa。

1.2 浸提液的制备与测试

将最低必需培养基-α（Gibco 公司，美国）、10%（体积分数）胎牛血清（Gibco公司，美国）、1%（质量分数）青链霉素溶液（Gibco 公司，美国）均匀混合得到完全培养基。浸提液根据文献[18]制备，即在每毫升完全培养基中放入0.1g3D打印WE43镁合金支架，在37℃的恒温培养箱中浸泡24h，得到浸提液。取1mL浸提液，放入超级微波消解系统（Milestone 公司，意大利）加入适量硝酸进行消解，完成后定容至20mL。用电感耦合等离子体发射光谱仪（Leeman公司，美国）测试定容后的溶液中镁、钇、钕、  钆和锆元素的浓度，测试3次后取平均值。

1.3细胞毒性试验

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC）提取于4周龄Sprague  Dawley（S-D）雄性大鼠股骨。提取后使用完全培养基，于37 ℃含 5%（体积分数）CO2 的细胞培养箱（Thermo Scientific 公司，美国）中培养。培养2d后使用胰蛋白酶（Gibco 公司，美国）消化细胞，之后将细胞接种在48孔板上传代培养，每孔含有1×104个细胞，每孔500μL 培养基，在培养环境中孵育24h让其贴壁。实验分为100%浸提液组、50%浸提液组、10%浸提液组及对照组，其中100%浸提液组、50%浸提液组、10%浸提液组分  别采用相应浓度浸提液培养，对照组采用完全培养基培养，每组3个复孔，  每3天更换培养基。之后，在第 1，3，7 天进行测试。测试过程为吸去每孔培养基，每孔加入180μL  完全培养基和20μL细胞计数试剂盒8（cell  countingkit-8，CCK-8）试剂 (Dojindo 公司,  日本)，放入37℃培养箱中，培养2h，之后使用酶标仪测试每孔在450nm处的吸光度。

1.4 动物实验

本研究经北京大学第三医院实验动物伦理委员会批准[批准号：（2020）动伦审第（003-01）号]。实验对象为27只新西兰大白兔，由北京大学第三医院实验动物中心提供，共分为3组，分别为实验组、骨水泥组和空白组，每组9只。动物麻醉后对股骨远端备皮，碘酊消毒后用医用乙醇脱碘。所有组别均暴露左股骨外侧髁，在外侧髁用骨钻制造直径为5mm、深6mm的骨缺损。实验组使用 WE43镁合金填充骨缺损，如图1所示，骨水泥组植入与镁合金相同体积的骨水泥柱，空白组不做填充。术后所有动物均皮下注射青霉素。在术后 4、8、12 周，每组分别采用二氧化碳麻醉法安乐死3只。安乐死后对左侧股骨、大脑顶叶皮质、心尖、左肺下叶、肝、左肾上极、脾取材，并进行4%（体积分数）多聚甲醛固定。

1.5 血生化测试

分别于 4、8、12周对各组动物耳缘静脉进行抽血，离心获得血清。使用全自动生化分析仪（深圳迈瑞，中国）对血清谷草转氨酶（aspartate transaminase,  ast ）、 肌 酐 （ creatinine,  crea ）、 乳 酸 脱 氢 酶 （ lactate dehydrogenase, LDH）进行检测。

1.6 Micro-CT 评估

在取材后，对股骨远 端行微计算机断层扫描（ micro-computed tomography，Micro-CT，Siemens 公司，德国），层厚设置为20μm。二维图像由扫描直接得到，三维图像经过重建后获得。

1.7 组织学评估

对内脏组织进行脱水，并用石蜡包埋。用切片机制作5μm 后的石蜡切 片。该切片用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin，HE)染色。用体积分数为 40%，75%，95%，100%梯度乙醇对左股骨远端脱水，之后用体积分数为 25%，50%，75%，100%梯度光聚树脂（Technovit 7200 ，EXAKT 公司，德国）浸塑，每个梯度1周。对浸塑完成的左股骨远端用光聚树脂包埋机包埋，之后用硬组织切片机和磨片机切片和磨片，最后制成 20 μm 后的磨片，磨片用亚甲基蓝酸性品红染色。

1.8 统计学分析

采用 SPSS 26.0（IBM公司 ，美国）软件进行统计分析，实验数据中的计量数据采用 x ± s 表示，组间差异的分析采用单因素方差分析 ，两两之间的事后比较采用最小显著性差异法（least-significant difference, LSD），P < 0.05 为差异有统计学意义。

2.1 浸提液测试

浸提液中镁的含量为(17.13±0.10)mmol/L，钇、钕、钆和锆均未达到电感耦合等离子体发射光谱仪检出限。

2.2细胞毒性试验

如图2所示，培养1d时，100%浸提液组、50%浸提液组、10%浸提液组细胞存活率均高于对照组，差异有统计学意义，100%浸提液组存活率为140.56% ±6.15%（P<0.01），50%浸提液组存活率为159.12%±5.04%（P<0.001），10%浸提液组存活率为 153.78%±15.43%（P<0.001）。培养3d时，各组细胞存活率差异   无统计学意义（P > 0.001）。培养7d时，100%浸提液细胞存活率低于对照组，细胞存活率为 68.64%±3.25%，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.3 血生化测试结果

手术后，各组大白兔均未出现死亡和感染等并发症 ，如图3所示，4 、8和12周血生化结果显示，各组AST 、CREA和LDH指标间差异无统计学意义。

2.4 Micro-CT 扫描结果

如图4所示，Micro-CT 冠状位片显示，对于实验组，4周时在植入物区域周围有明显的气体产生，尤其是在股骨远端的骺线以下，在骨干部也可见少量气体，8周和12周并未见有明显气体积聚。4周时仍然可见较清晰的支架轮廓，8周时支架轮廓较模糊。12周时已无明显支架轮廓。和4周和8周对比，12周植入物周围新生松质骨更加丰富。从4周开始至12周，均可见较少高密度的未降解金属。骨水泥组4周时所植入的硫酸钙骨水泥已大部分降解，至12周时Micro-CT结果中已不可见明显硫酸钙骨水泥。空白组未发现有明显气体积聚，随时间延长，仍可见明显骨缺损。通过Micro-CT 对实验组二维图像进行重建，计算出4周时气体体积为(32.14±15.98)mm3 ，8周时为(1.73±1.38)mm3 ，12周时为(1.05±1.16)mm3。图5所示为实验组术后12周的股骨干和股骨近端的二维图像，未见明显气体存在。

2.5 组织学分析

亚甲基蓝酸性品红染色结果显示如图 6，手术4周后实验组中降解的支架周围有蓝紫色的细胞外基质和类骨质的出现；8周时支架植入的缺损区域的骨小梁较4周明显增多，细胞外基质与类骨质也较4周更多；12周时可见降解的支架周围有红色的新生骨围绕假体生长，新生骨旁仍有细胞外基质和类骨质。骨水泥组中，4周时可见骨水泥已大部分降解，至12周时骨缺损愈合不明显。空白组中，4 周时仍可见少量细胞外基质，但排列不规律，8周时骨缺损区未见明显的骨生长，12周时骨缺损修复不良，光镜下只可见少量新生骨。

如图7所示 ，12周时对实验组动物的肝小叶、肾皮质、脑皮质 、心肌、 脾脏 、肺泡等结构进行了观察，均未见明确病理学改变。

骨缺损一直是临床治疗的难点，骨缺损填充材料的研究是热点问题 。本研究采用新型3D打印镁合金WE43支架，孔隙率为60%，与骨的杨氏模量相近。体外生物相容性方面，在100%、50%、10%三个浓度梯度中仅100%浓度浸提液培养7d时表现出一定细胞毒性。对于BMSC，镁离子在一定范围内会呈现出促进细胞增殖的作用，亦会有促进成骨的作用，尽管在更高的浓度会 表现出一定的细胞毒性。

正常生理状态下，人体松质骨的杨氏模量为10~3 000MPa，而抗压强度比杨氏模量小两个数量级，为0.1~30 MPa[19]。本研究所制造的WE43镁合金，
其杨氏模量均与人体松质骨相仿。人体的股骨干中段的杨氏模量约为  18.6 GPa，远大于3D打印的WE43支架的杨氏模量，故3D打印的WE43镁合金
更适合修复非承重区骨缺损，而未来需要改进其内部结构，增加其模量， 以有益于修复皮质骨缺损[20]。

有研究显示，浓度为 1~4mmol/L时的镁离子，促进人成骨细胞的增殖最为明显，在 16 mmol/L 时呈抑制作用[21]。本实验采用的是S-D大鼠的 BMSC，浸提液浓度明显高于镁离子最佳促成骨浓度，但在1d时有促进细胞增殖的作用。在培养7d时，100%浸提液的细胞存活率低于对照组，而50%和 10%浓度浸提液与对照组之间差异无统计学意义，说明了较高的镁离子浓度在培养7d时对BMSC的增殖有抑制作用，更长时间的培养可能体现出不同镁离子浓度的生物学效应，也提示需要对镁合金的降解速率进行进一步改善。

本研究显示，Micro-CT在4周至12周观察时间窗内，降解的支架周围的骨质随生长时间的延长而增加，在12周时支架及其降解产物周围已有较多的类骨质，这在切片染色中得到证实。由于WE43镁合金降解产物的密度和松质骨有重叠，故未计算骨缺损中新生松质骨体积。在4周时，大部分支架均已降解，高密度的支架所剩很少，其8周与12周的降解情况与4周相仿。有文献报道一些镁合金可促进植入区域骨组织的生长，而其他的镁合金仅可促进植入区域纤维的生长[22-23]。本研究中12周的股骨髁硬组织切片显示，在整个骨缺损区，几乎都有成骨细胞与丰富的细胞外基质的存在，表明3D打印多孔的WE43镁合金在成骨方面有着明显的促进作用。硫酸钙骨水泥作为常用的骨填充材料在Micro-CT实验中显示4周时大部分已降解，12周时骨缺损愈合较差，缺损区域内骨生长较少。硬组织切片显示在4周时，骨缺损内仅存少量骨水泥，少量新生骨小梁包绕骨水泥生长；12周时已无明显的骨水泥残余，和4周相似，存在较明显的骨缺损，骨愈合不良。空白组Micro-CT 显示4至12周骨缺损均未得到明显的修复，骨缺损处仅存有少量细胞外基质，无明显的成骨细胞的生长。综合Micro-CT 和切片结果，可以发现早期支架降解生成的气体对新生骨的形成影响较小。体内中镁离子的最佳成骨浓度为1~4mmol/L。浸提液的制备过程中，液体不流动，考虑到植入物周围的血液循环，其浓度可能比制备的浸提液浓度更低，即可能更适合骨生长。

本研究中，Micro-CT 显示在4周时实验组股骨髁有明显的气体产生，并集中在股骨干骺端。在8周和12周的 Micro-CT 图像上看，镁合金支架已经明显吸收 ，周边无明显气体存在 ，说明3D打印镁合金在体内的降解速率较快 ，需要进一步研究控制其降解速率，但相对于硫酸钙骨水泥，其降解速率已明显减慢。12周的股骨干和股骨近端的图像并未显示出有明显气体，说明股骨干和股骨近端不易有气体残留。由于不同镁合金的降解速率差异较大，降解速率更快的合金不一定呈现出气体腔隙的形成，这和金属结构、植入部位和时间均相关[24-25]，通过改善降解速率，有利于减小气腔的产生。

稀土元素对细胞及动物的影响均值得考虑。 既往文献显示，离子化的稀土元素，如钇、钕、钆，表现出明显的细胞毒性，浓度均为约 1 000 μmol/L[26] 。 根据文献，钇、钕、钆的检出限分别为0.219 、0.041 和 0.406 μg/L [27] 。本实验测试了稀释20倍的浸提液中稀土元素的浓度，发现其浓度在电感耦合等离子体发射光谱仪检出限以下，即浸提液的钇、钕、钆元素的浓度小于4.374 、 0.810 和 8.128 μg/L，远小于稀土元素产生明显细胞毒性所需要的浓度，故在体外实验环境中，稀土元素对细胞毒性的影响较小。尽管如此，仍有镁合金相关动物实验表明，含有稀土元素的镁合金在植入后其内脏的稀土元素含量随时间的增加而增加，并在脾脏有明显增加，故稀土元素在体内富集对生物的影响值得研究[28]。

综上，3D打印工艺制造的多孔 WE43镁合金支架的生物相容性良好，具有良好的成骨性能，可作为潜在的骨缺损修复材料。