1.1   主要材料和仪器

含有羟基磷灰石的兔下颌骨组织样本由济宁市第一 人民医院医学美容科提供。EXAKT300CP/400CS/AW 硬组织切磨系统购自德国EXAKT公司。苏木素－伊红( HE) 染色试剂盒、甲苯胺蓝染色液(1% , 硼酸盐法）、钙盐 (VonKossa) 染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。Weigert苏木素染色试剂盒、VanGieson(VG)染色试剂盒、亚甲基蓝-酸性品红染色试剂盒购自雷根生物科技有限公司。 Goldner三色法染色试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2    硬组织切片的制作

新鲜含有羟基磷灰石的兔下颌骨组织经 40g/L 多聚甲醛固定48h, 乙醇逐级上行脱水、丙烯酸甲脂逐级浸润共24d后，光固化聚合包埋，使用EX-AKT300CP/400CS/AW硬组织切磨系统（德国EXAKT公司）制成50μm厚的切片，打磨抛光去除划痕，用于后续实验。

1.3    HE 染色

1.4    Weigert 苏木素－甲苯胺蓝染色

Weigert苏木素A、B液1∶1混合（现用现配），将1.2中组织切片染色3min, 流水冲洗30s后晾干，甲苯胺蓝染色液(1% ,硼酸盐法）染色40s, 流水冲洗1min,自然晾干后中性树胶封片。

1.5  Weigert 苏木素-Ladewig 染色

将 1g苯胺蓝与 4g橙黄G 溶于200  mL蒸馏水中，加入16mL醋酸品红，煮沸3min, 冷却后过滤，制成Ladewig混合液，备用。Weigert苏木素A液和 B液1∶1混合（现用现配），将1.2中组织切片染色3min,流水冲洗30s后晾干，Ladewig混合液染色5min, 流水冲洗1min至浅蓝色，自然晾干后中性树胶封片。

1.6 Weigert 苏木素-Van Gieson(VG)染色

Weigert苏木素 A液和 B液 1∶1混合（现用现配），将1.2 中组织切片染色3min, 流水冲洗30s后晾干，VG染液A液和B液1∶9混合（现用现配），染色3min, 体积分数0.95乙醇急速分化3~5s,自然晾干后中性树胶封片。

1.7  亚甲基蓝－酸性品红染色

将 1.2 中组织切片以亚甲基蓝染色10min , 滤纸吸干染液，蒸馏水漂洗1min后晾干，酸性品红染液染色3min , 蒸馏水快速漂洗3~5s , 自然晾干后中性树胶封片 。

1.8   Goldner 三色法染色

Weigert苏木素 A液和 B液 1∶1混合（现用现配），将1.2中的组织切片染色 3 min,流水 冲洗30s, 晾干后酸性品红染色3min,0.2%冰醋酸快速漂洗2次，每次3~5s, 橙黄G染色3min, 显微镜下观察到胶原处红色褪去。以酸性品红再次染色3min后，0.2%冰醋酸快速漂洗2次，每次3~5s,亮绿染液染色3min,而后以 0.2%冰醋酸快速漂洗2次，每次3~5s,自然晾干后中性树胶封片。

1.9   钙盐(Von Kossa)染色

将 1.2中的组织切片滴加VonKossa银溶液后放置于强烈太阳光下照射30min,使用蒸馏水漂洗1min,海波溶液染色2min,自然晾干以后用中性树胶封片。

2.1    HE 染色结果

HE染色结果 显示，含有羟基磷灰石的兔下颌骨组织中骨组织呈红色，颜色较单一（图1A)；附着软组织、类骨质和成骨细胞着色不明显，新生骨组织和原矿化骨无明显界限（图1B~E)。

2.2    Weigert 苏木素－甲苯胺蓝染色结果

Weigert 苏木素－甲苯胺蓝染色结果显示，含有羟基磷灰石的兔下颌骨组织中骨组织整体呈蓝色（图 2A)；附着软组织和类骨质着色不明显（图 2B~ D),难以区分；新生骨深染呈深蓝色，原矿化骨呈蓝紫色，界限较清晰，成骨细胞核呈蓝色（图 2E)。

2.3    Weigert 苏木素-Ladewig 染色结果

2.4   Weigert 苏木素-VG 染色结果

Weigert苏木素-VG染色结果显示，含有羟基磷灰石的兔下颌骨组织中骨组织呈鲜红色（图4A);牙龈等附着软组织呈浅黄色（图 4B)；靠近植入物的未矿化骨和类骨质呈黄色（图4C、D)；新生骨深染（图4D)；植入物内部和周围有大量成骨细胞，其中成骨细胞核呈黄色，细胞基质呈浅黄色（图 4E)。

2.5   亚甲基蓝－酸性品红染色结果

亚甲基蓝－酸性品红染色结果显示，含有羟基磷灰石的兔下颌骨组织中组织的颜色对比明显，骨组织呈红色（图 5A)；牙龈等附着软组织呈深蓝色（图5B)；靠近植入物的新生骨颜色较深，呈深红色，原矿化骨呈浅红色（图5C、D)；植入物内部和周围可见大量成骨细胞，其中成骨细胞核呈深蓝色，细胞基质呈淡蓝色，类骨质呈紫灰色（图5E)。

2.6    Goldner 三色法染色结果

Goldner三色法 染 色 结 果 显 示，含 有 羟 基 磷 灰石的兔下颌骨组织当中组织的颜色对比明显，骨组织呈绿色（图 6A)；附着软组织呈浅黄色（图6B),不易观察；靠近植入物的新生骨颜色较深，呈深绿色（图6C)；成骨细胞呈浅黄色，因着色较浅难以分辨成骨细胞核和细胞基质（图6D)；类骨质呈橙红、橙黄相间（图6E)。

2.7    Von Kossa 染色结果

在组织形态学的观察和研究过程当中，含有植入物的硬组织一般采用非脱钙的方式制成硬组织切片，新鲜组织经过固定和乙醇逐级上行脱水后放入丙烯酸甲酯中浸泡，在真空条件下丙烯酸甲酯缓缓浸润组织，经过光固化聚合，组织与丙烯酸甲酯融为

一体形成包埋块，经过切磨抛光以后制成厚度 大约50μm的切片[7-8]  。该切片染色前无需脱塑（若强行脱塑极易脱片）和水化，按照常规流程进行染色时极易出现组织着色过深、着色过浅或脱片等染色不良事件[9-10]  。含有植入物的硬组织相对较珍贵，染色不良会严重影响组织形态学观察和计量分析，因此针对非脱钙硬组织切片标准化染色流程的制定尤为重要。硬组织切片的制作过程中采用树脂包埋，应尽量避免接触有机溶剂[11], 且染色前不脱塑不水化，通常染色时间较短；若染色时间过长则会导致着色太深，影响镜下观察。本课题组前期对多种染色方法的染色时间、温度和洗脱步骤进行了优化。本研究通过对含有羟基磷灰石的兔下颌骨组织切片进行不同方法的染色，对比不同染色方法在骨组织形态学观察中的应用范围和局限性，旨在优化不同观测目的下含植入物非脱钙骨组织切片的染色方法。

骨组织由骨细胞和钙化的细胞外基质构成 。细胞外基质又称骨基质，含有机质和无机质两种成分；其中有机质中90%为胶原纤维，因此骨组织切片染色呈嗜酸性；无机质即骨盐，富含钙、磷等元素。骨基质早期没有骨盐沉积，称为类骨质，经过钙化或矿化方成为坚硬的骨质[12]  。HE染色法中伊红为酸性染料，可以使骨组织细胞质和细胞外基质呈红色。本研究中对含有羟基磷灰石的兔下颌骨硬组织切片进行HE染色，结果显示该染色法不能全面地概括骨组织各组分情况，可用于骨组织的常规观察，与其他研究结果类似[13-15] ；在软骨组织的研究中，单一的甲苯胺蓝染色可以让软骨组织和成骨细胞呈现蓝紫色，用于软骨组织的特异性观察[16-18]  。本研究结果显示，将甲苯胺蓝和Weigert苏木素搭配染色，可以使骨组织和成骨细胞核呈蓝色，且新生骨深染，与原矿化骨界限较明显，适用于观察新骨生成和测量植入物周围骨结合面积；Weigert苏木素-Ladewig染色和Weigert苏木素-VG染色的原理相似，都可用于区分胶原纤维和肌纤维，Weigert苏木素-Lade- wig染色后原矿化骨和新骨组织没有明显界限，不易区分，适用于观察附着软组织生长、植入物骨结合和骨缺损后的成骨细胞生长情况；相比于Weigert苏木素-Ladewig染色，Weigert苏木素-VG染色后软组织、成骨细胞等着色较浅，适用于观察新骨生成和测量植入物周围骨结合面积，本结论也与其他的研究结果类似[19-22]  。另外，本研究结果显示，亚甲基蓝－酸性品红染色应用范围较全面，可满足各类组织形态观察和计量需求，其他种植体骨结合研究中该染色结果与本研究相似[23]  。本课题组前期染色实验发现，Masson三色法染色不适用于非脱钙的硬组织切片，染色结果呈现大面积深红色，且苯胺蓝较难着色，导致新生骨难以辨别。本研究中，Goldner三色法染色是Masson三色法染色的改良版，可以较清晰地展示新生骨、原矿化骨和类骨质的形态结构。本研究结果显示，VonKossa染色可特异性展现钙盐沉积区域，适用于分析成骨活性或观察钙化区域，与其他研究结果类似[24]  。

综上所述，本研究通过系统对比不同染色方法对于含羟基磷灰石植入物的兔下颌骨非脱钙硬组织切片的染色效果，明确了不同观察目 的下对于含植入物硬组织切片的染色方案：如果需要高精度测量新生骨和原矿化骨比值及骨结合面积，推荐使用Weigert苏木素-VG染色或者Weigert苏木素－甲苯胺蓝染色；如需同时了解骨组织矿化状态（类骨质/新生骨／原矿化骨）及软组织／细胞情况，推荐使用亚甲基蓝－酸性品红染色或者Goldner三色法染色；如需分析骨组织的成骨活性或观察钙化区域，则推荐使用VonKossa染色。